一种基于微流控的仿生方法，用于制造体外3D肝小叶样微组织。
Introduction
肝组织工程在过去的几十年里一直吸引着科学界、制药界和临床界的广泛关注，因为它有可能为肝功能衰竭的患者提供功能支持/替代，或者为研究肝细胞功能、肝病以及药物代谢和毒性提供体外组织模型。传统的肝组织工程技术主要采用“自上而下”的策略，其中肝细胞被接种在一个预成型的聚合物支架上，在生理线索的帮助下定植于支架上，并生成合适的细胞外基质（ECM）和形态结构。
尽管通过研究更具有仿生性的框架（如去细胞的ECM支架）取得了重要进展，自上而下的方法通常难以复制复杂的肝组织微结构特征。与之相比，自下而上的方法被提出以改善工程组织中的细胞控制，通过合并简化的构件来制造分层的组织。
这种情况下，一种预先构建的、类似于肝小叶（一种由肝细胞索和肝血窦状放射状排列形成的精心安排的肝单位）的肝组织构件是非常可取的。此前已经有工作使肝细胞形成线性排列的肝索样结构，一般来说，这些体外肝细胞培养系统或可用于研究毒性的具体方面。然而，这些系统未能组织异质细胞类型，以模仿高级的肝脏架构（即肝血窦），可以保留细胞-细胞和细胞-ECM的相互作用。
本研究提出了一个微流控仿生方法用于在体外制造3D肝小叶样微组织，该组织由放射状图案化的肝索状网络和内在的肝血窦状网络组成。功能表征显示该3D仿生肝小叶样微组织在相I/II阶段保持了更高的基础肝特异性功能（也就是CYP-1A1/2和UGT活性）
Figure 1. Biomimetic construction of a 3D liver lobule-like microtissue
- （a）肝脏结构的示意图。
- （b）肝血窦由肝细胞和内皮细胞组成，呈索状排列，相当于（a）中的区域。
- （c）仿生微流控装置的三维布局。该装置有一个六边形的细胞培养室，其中有一个放射状的微图案柱阵列和一个气动的微阀系统（PμS，用红色标示）。
- （d）放大图像显示了装置的设计细节，相当于（c）中的区域。
- （e）3D仿生微组织的微工程构建、功能评价和药理应用实验流程。
Figure 2. Schematic diagram illustrating the sequential procedure for constructing the biomimetic microtissue
- （a）将HepG2细胞（黄色粒子）和胶原的冰冷混合物轻柔地引入腔室。
- （b）通过微阀系统形成肝索样网络。
- （c）HAECs（蓝色粒子）添加入入口。
- （d）通过内阀的关闭被动流入预形成的凝胶通道，被外阀所阻挡。
Figure 3. Morphological demonstration of the 3D liver lobule-like microtissue
- （a）制造的肝小叶样微组织由肝索样网络（i）和肝血窦样网络（ii）组成。（i）和（ii）分别由24张图像利用图像处理软件合成。（iii）为（i）和（ii）的重叠图。
- （b）单个肝血窦样结构的放大图，其中HAECs与HepG2细胞形成的相应的肝索排成一排。
- （c）肝血窦样结构的三维视图。
Figure 4. Hepatic enzyme activity of the biomimetic microtissue
- （a）酶活性检测实验的时间流程。对经过 72 h 培养后三种培养模型分别给予不同药物的不同剂量24 h处理。药物处理后，测定酶活性。
- （b）为更好地表征肝小叶样肝脏芯片的酶活力，实验中定义和构建了三种 HepG2 细胞培养模型，即 Hep-2D 模型、Hep-3D 模型和肝小叶样肝脏芯片模型。
- （c）CYP-1A1/2和UGT活性。结果显示，肝小叶样微组织比Hep-3D培养模型保持较高的基础酶活性，而后者又高于 Hep-2D 培养模型。经过诱导剂（如奥美拉唑（OME）和利福平（RIF））或抑制剂（环丙沙星（CPFX）和丙磺舒（PBD））处理后，肝小叶样肝脏芯片的 CYP-1A1/2 和 UGT 酶活力表现出显著增加或减少。
Figure 5. Drug sensitivity of the biomimetic microtissue
- （a）药物敏感性分析实验的时间流程。
- （b）APAP诱导的急性肝毒性。
- （c）INH诱导的急性肝毒性。
- （d）RIF诱导的急性肝毒性。
- （e）三种培养组。
MTT试验原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶NADPH还原四甲基偶氮唑蓝MTT生成紫色结晶沉淀-甲瓒化合物，而死细胞无此功能。
FDA，中文名为二乙酸荧光素，是一种具细胞膜渗透性的酯酶底物，常用作细胞活力分析。不仅可以测定酯酶活力，因FDA需要在酯酶的催化下才能活化产生绿色荧光；而且还可用来鉴定细胞膜完整性，只有在完整膜内才能维持荧光。也可用于流式分析。最大激发波长（Ex）和发射波长（Em）分别为490nm和526nm。
Figure 6. Detection of drug–drug interactions via the biomimetic microtissue
APAP，作为经典肝毒性药物模型，被选为目标测试药物。一般情况下，即使用正常剂量时，约 90%的APAP经相II肝代谢酶（UGT）等转化为无毒的化合物，并排泄到胆汁或尿液中。余下的约 5~9%的APAP由相I肝代谢酶，即细胞色素P450酶（CYP-1A1/2），代谢生成N-乙酰基-对苯醌亚胺（NAPQI）。NAPQI可以与细胞内的谷胱甘肽结合，被有效地解毒。然而，如果过量服用 APAP，肝细胞内将代谢产生过量的NAPQI，这些NAPQI不仅会耗尽细胞内的谷胱甘肽，而且与细胞内蛋白共价结合、诱导的氧化应激，最终导致肝损伤。
- （a） APAP 的肝脏代谢途径和不同药物的潜在影响。
- （b）药物相互作用检测试验的时间流程。
- （c）由此产生的肝细胞活性。
APAP-OME药物组合处理增加了HepG2细胞的死亡率，而APAP-CFPX药物组合处理提高了细胞的存活率。同样，RIF预处理减轻了APAP诱导的肝毒性，而PBD预处理加剧了APAP的肝毒性作用。结果表明，肝小叶样肝脏芯片可以于体外再现CYP-1A1/2或UGT介导的药物间相互作用。这些结果证实了肝小叶样肝脏芯片可以作为一个可靠、有用的组织模型用于潜在的药物不良反应分析研究。
Conclusion
- 开发了一种基于微流控的仿生肝小叶样微组织。利用气阀可以在微尺度分辨率下以3D方式操纵不同的细胞类型，即肝细胞（HepG2细胞）和非实质细胞（HAECs）。
- 代谢活力试验表明，肝小叶样微组织比2D培养具有更好的CYP-1A1/2和UGT酶活力，同时也可以应答与这两类酶的特定诱导剂和抑制剂。
- 肝毒性试验表明，肝小叶样微组织比2D培养状态下更敏感，可以有效响应不同药物的肝毒性。
- 药物相互作用分析试验表明，肝小叶样微组织于体外再现了CYP-1A1/2或UGT介导的药物间相互作用，证实了其可以作为一个可靠、有用的组织模型用于潜在的药物不良反应分析研究。
Reference
Ma C, Zhao L, Zhou E-M, et al. On-Chip Construction of Liver Lobule-like Microtissue and Its Application for Adverse Drug Reaction Assay[J]. Analytical Chemistry, 2016, 88(3): 1719–1727.
